目的：通過此教程，了解Discovery Studio中基于蛋白序列構建同源跨膜蛋白模型的操作方法及結果分析。

所需功能和模塊：Discovery Studio Client，DS Sequence Analysis，DS MODELER，DS Protein Families。

所需數據文件：2rh1.pdb，ADRB1_HUMAN.fasta。

(相關資料圖)

所需時間：0.5小時

介紹

膜蛋白在藥物研發領域中是一類非常重要的靶標蛋白，這是由于該類蛋白，尤其是GPCR（G蛋白偶聯受體），是目前許多已知藥物以及仍處于研發階段的大量藥物分子的目標靶點。GPCR是一類七次跨膜受體蛋白，它們廣泛地參與細胞增殖、分化、遷移，尤其是各類生理活動的調控。從近幾十年藥物發展的歷史看，全球70%所開發的藥物都是針對GPCR的，因此GPCR是令人矚目的藥物治療靶點。

本教程即演示了如何使用DS中已有的一系列工具（tools）和流程（protocols），以beta-2腎上腺素受體X-衍射晶體結構為模板，來構建beta-1腎上腺素受體的同源模型并進行加膜處理。

本教程包括以下步驟：

輸入beta-1腎上腺素受體的序列及beta-2腎上腺素受體模板結構

預測蛋白的跨膜區

將目標序列比對至模板序列

構建3D同源模型

添加隱性生物膜至構建得到的模型

調整生物膜的位置

打開輸入文件

在文件瀏覽器（Files Explorer）中，展開Samples | Tutorials | Protein Modeling文件夾，雙擊打開ADRB1_HUMAN.fasta序列文件。

這將在一個名稱為ADRB1_HUMAN新的序列窗口中打開beta-1腎上腺素受體的一級序列（序列名為ADRB1_HUMAN）。

構建同源模型的第一步是識別合適的模板。如果同目標序列的序列一致性較高的模板存在，通常可以通過簡單的BLAST搜索得到該模板結構。對于膜蛋白而言，X-單晶衍射解析得到的晶體結構非常有限，因此本教程不包含模板識別這一步驟（該步驟細節可以參看MODELLER教程）。

本教程采用最近解析出來的beta-2腎上腺素受體晶體結構（PDB號：2rh1）作為模板。

在文件瀏覽器（Files Explorer）中，展開Samples | Tutorials | Protein Modeling文件夾，雙擊打開2rh1.pdb文件。

蛋白2rh1.pdb在分子窗口中顯示。

注：采用BLAST搜索PDB_nr95數據庫可以找到另一個可能的模板，火雞beta-1腎上腺素受體。該晶體結構同目標序列的序列一致性高達70.5%，是一個比較好的模板結構。然而，本教程采用2rh1作為模板是想突出DS的功能，因為在模板序列一致性如此高的情況下，軟件功能在很大程度上是不太相關的。

建模的下一步：將目標序列與模板序列進行序列比對。首先需要將目標序列和模板序列置于同一個序列窗口當中。

點擊激活ADRB1_HUMAN序列窗口。

在窗口中點擊右鍵選擇Insert Sequence | From Windows…

打開Insert Sequence from Windows對話框。

選擇2rh1點擊OK。

將2rh1序列插入ADRB1_HUMAN序列窗口當中。

注：此時兩序列并未進行比對，狀態欄（DS窗口左下角）顯示了兩序列之間的序列一致性及相似性情況（分別為7.0%，27.4%）。

預測蛋白的跨膜區

序列比對流程允許利用蛋白的二級結構信息來提高序列比對的精度。二級結構預測方法，如DSC，是基于球蛋白的溶劑暴露模式來定義的。膜蛋白的表面大部分都暴露于生物膜內部的脂質環境中而非水環境。這就導致了氨基酸序列中疏水殘基和親水殘基模式的不同，從而使得標準的二級結構預測方法來預測膜蛋白的二級結構不太可靠。本教程則采用專門用于預測膜蛋白螺旋區的的TransMem方法。

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Analyze Transmembrane Proteins，點擊Predict Transmembrane Helices。

在ADRB1_HUMAN序列窗口中相應地添加了蛋白二級結構卡通圖，紅色橫條表示alpha-螺旋，藍色箭頭表示beta-折疊。（圖1）

圖1

注：預測2rh1的跨膜螺旋時，有一段區域（ASN1002—TYR1161）是沒有預測到螺旋結構的。該區域對應的是一個為方便結晶與β-2腎上腺素受體融合的溶菌酶的序列。標準的二級結構預測方法可以預測出該區域的二級結構。如果將二級結構預測結果用于指導序列比對，如此大的序列插入會擾亂比對的結果。

將目標序列與模板序列進行比對

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Align Sequence and Structures，點擊Align Sequences…打開Align Sequences對話框。

確保Input Sequence Set設置為ADRB1_HUMAN:All。

點擊Use Secondary Structures右邊的下拉菜單，選擇TRANSMEM。（圖2）

點擊Run運行作業，等待作業完成。

該作業大概需要1.5min的時間（奔騰4，3GHz的CPU，1GB的存儲器）。

作業完成以后，ADRB1_HUMAN序列窗口會自動更新為序列比對之后的結果（圖3），同時彈出序列一致性和序列相似性（42.1%，53.3%）報告的對話框（圖3）。

點擊OK關閉該對話框。

圖2 “Align Sequences”參數設置

圖3

構建目標序列的3D同源模型

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Create Homology Models，點擊Build Homology Models，打開Build Homology Models對話框。

點擊Input Sequence Alignment右邊的柵格，下拉列表中選取ADRB1_HUMAN:All。

點擊Input Templates Structures一欄，選擇2rh1。

點擊Input Model Sequence右邊的柵格，下拉列表中選取ADRB1_HUMAN。

展開Copy From Templates參數欄，點擊Ligands參數欄，選擇2rh1:A:CLR412，2rh1:A:CLR413，2rh1:A:CLR414，2rh1:A:PLM415。

該步驟將棕櫚酸和膽固醇分子從模板結構中直接復制到模型結構當中。這些分子有助于決定生物膜相對于模型結構的位置。

將Number of Models設為1。

點擊Optimization Level右邊的柵格，下拉列表中選取Low。（圖4）

注：將Optimization Level由默認值改為Low，可以加快計算速度，但產生的模型的精度會下降。

圖4 “Build Homology Models”參數設置

點擊Run運行該作業。

該作業大概需要1min的時間（奔騰4，3GHz的CPU，1GB的存儲器）。

待作業完成以后，構建得到的模型在名為ADRB1_HUMAN的分子窗口中打開（圖5），同時有一個報告PDF Total Energy的對話框彈出。

點擊OK關閉該對話框。

圖5

給模型添加隱性生物膜結構

DS為用戶提供了為蛋白質結構添加和控制隱性膜結構的工具。該膜結構的位置可以用在模擬（simulation）流程中以明確蛋白質在隱性溶劑模型中的溶劑化性質。

在菜單欄中，選擇Edit | Preferences…以顯示 Preferences 對話框。

在Transmembrane Protein 頁面中, 確保Membrane Thickness的設置為30 ?（圖6）。

點擊OK關閉Preferences對話框。

這里所說的Membrane thickness指的是膜的疏水區，不包括磷脂的極性頭部所占據的區域。

圖6

點擊并激活ADRB1_HUMAN分子窗口。

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Analyze Transmembrane Proteins，在Create and Edit Membrane欄下點擊Add。

該步將為蛋白質結構添加一個膜結構。該膜在分子窗口的圖形界面上以兩個平行的平板表示（圖7）。

圖7

調整膜的位置

Add命令只使用一個非常簡單的溶劑模型來確定膜結構的位置。做這樣的優化處理更多地是考慮到了速度而非精度。因此，通常都需要對膜的位置進行重新調整。

在系統（Hierarchy）視圖中，展開ADRB1_HUMAN.M0001,點擊選中B鏈以選中模型中的膽固醇和棕櫚酸分子。

注意到，膽固醇和棕櫚酸分子的極性區域都處于以兩個平板所定義的膜結構的疏水區(圖8)。這表明初始構建的膜的位置需要調整。

使用Add Membrane and Orient Molecule流程可以自動完成上述膜結構位置的調整過程。該protocol使用廣義伯恩（GB）溶劑模型對膜的位置進行全面優化。由于此步計算需要非常長的計算時間，所以本教程使用Analyze Transmembrane Proteins工具面板來調整膜結構的位置。

在系統（Hierarchy）視圖中，展開ADRB1_HUMAN.M0001,點擊選中A鏈。

在工具瀏覽器（Tools Explorer）中，展開Macromolecules | Analyze Transmembrane Proteins，在Create and Edit Membrane欄下點擊Add Orientation Monitor。

這將在模型結構窗口中添加一個膜取向調節坐標（membrane orientation monitor），用以指示膜與蛋白質主軸間的移動（shift），傾斜（tilt）及旋轉（rotation）角度（圖8）。

圖8

點擊Modify…

打開Edit Membrane對話框。

設定Shift為4.8 ?，Tilt 為15.5度，Rotation 為30.0度。

點擊OK。

點擊3D窗口中任一位置，從而不選中蛋白質。

在菜單中Display Style中選擇第一種表示方式.

調整后的膜結構中，膽固醇和棕櫚酸分子的極性區都位于生物膜疏水區的外側（圖9）。

圖9